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熒光觀(guān)察是現代科研、生命科學(xué)和醫學(xué)檢查中都廣泛應用的一種觀(guān)察方式,那么熒光觀(guān)察用什么物鏡呢?有些老師可能就說(shuō)要用“熒光物鏡",但“熒光物鏡"到底是什么意思?跟普通物鏡又有什么區別?如果您搞不明白,今天這篇文章可以為您解惑。
熒光物鏡
熒光物鏡,從字面上來(lái)看,就是適合熒光觀(guān)察的物鏡,雖然它的確適合熒光觀(guān)察,但這并不是它名字來(lái)由。
螢石鏡片
熒光物鏡(Fluor)現在的標準稱(chēng)呼其實(shí)是“半復消色差物鏡"(Semi-Apo)或者“平場(chǎng)半復消色差物鏡",因為這種物鏡生產(chǎn)時(shí)使用到了螢石(Fluorite)鏡片,故稱(chēng)“螢石物鏡"、“熒光物鏡"。實(shí)際在無(wú)限遠光學(xué)時(shí)代,半復消色差物鏡已經(jīng)可以不用螢石鏡片也能做出來(lái)。
相比普通物鏡,熒光物鏡不僅在熒光觀(guān)察中有更好的表現,在明場(chǎng)、暗場(chǎng)等觀(guān)察中,它也因為有更高的數值孔徑、更強的消色差表現,能提供更明亮、更高對比度的清晰成像。
普通平場(chǎng)消色差物鏡
消色差物鏡(Ach)/平場(chǎng)消色差物鏡(Plan Ach),都是主流,這些就是普通物鏡。熒光物鏡是半復消色差物鏡/平場(chǎng)半復消色差物鏡,與普通物鏡區別在于消色差水平。
白光通過(guò)三棱鏡折射出七色光譜
要理解兩者區別,首先得搞明白什么是色差(Chromatic Aberration)。陽(yáng)光可以形成“赤橙黃綠青藍紫"七色彩虹,因為它的光譜包含這些顏色。
軸向色差
在通過(guò)透鏡時(shí),光譜中不同顏色的光會(huì )在不同的焦面聚焦,藍色在距離透鏡近的距離聚焦,綠色還得遠一點(diǎn),紅色離得更遠,這意味著(zhù)紅綠藍三色無(wú)法在同個(gè)焦面聚焦,成像會(huì )偏色,同時(shí)高對比的邊緣會(huì )有不聚焦的其他顏色,通常呈現為紫邊、暈環(huán),影響對比度和清晰度,這就是軸向色差(Axial Chromatic Aberration).
橫向色差(光路圖虛線(xiàn)部分)
另一種色差,是同一顏色的光通過(guò)鏡片中間和鏡片邊緣時(shí),會(huì )在聚焦面形成不一致的放大效果,如中間是1.0倍,邊緣可能就是1.3倍,這個(gè)倍率差異每個(gè)顏色都有,而且每個(gè)顏色的差異不一致,其結果就是在成像外圍一圈的成像出現彩色的邊緣,這就是放大率色差,或者叫橫向色差(Lateral Chromatic Aberration).
軸向色差在成像Z軸,橫向色差在成像XY軸,前者只能在物鏡層面校正,后者的校正方法比較復雜,固定筒長(cháng)和無(wú)限遠光學(xué)有不同策略,不同品牌之間也有差異,我們先略過(guò),后面再說(shuō)。
消色差鏡組
18世紀,光學(xué)家John Dollond發(fā)明了消色差鏡組,將紅藍兩色聚焦到跟綠色焦面相近的焦面,從而大大減少了軸向色差,提升了清晰度,而且他的設計成本夠低,因此消色差物鏡自此逐漸成為了望遠鏡和顯微鏡的基本配置,直至今天。普通消色差設計,可以校正紅藍兩色色差,以及綠色波段的球差。
熒光物鏡規格對比
熒光物鏡,或者說(shuō)半復消色差物鏡,通過(guò)引入螢石鏡片等先進(jìn)材料和更復雜鏡組,進(jìn)一步強化了軸向色差校正能力,可以將紅綠藍三色甚至四色聚焦到同一個(gè)焦面,并校正紅綠藍三色甚至四色的球差。
熒光物鏡工作距離較普通消色差更短,擁有顯著(zhù)更高的數值孔徑(N.A),成像更清晰、銳利、高襯度,另外熒光物鏡成像像場(chǎng)普遍達到26.5mm,適合搭配25mm超寬視場(chǎng)目鏡,比普通消色差18-23mm的視場(chǎng)大一圈,在各種鏡檢觀(guān)察中,你都能明顯體驗到半復消色差相對普通消色差帶來(lái)的巨大提升。
高分辨率成像通常用APO物鏡
如果加入更多鏡組,將色差校正提升到四色或者五色水平,就得到復消色差物鏡(APO)了,它工作距離更短,數值孔徑更高,幾乎把整個(gè)光譜的色差都給消除了,適合各種高分辨率成像,但對于大部分鏡檢來(lái)說(shuō),從半復消色差到復消色差的提升并沒(méi)有那么巨大,因此鏡檢應用中并不普及。
需要補充的是,熒光物鏡也是有效果差異的,有些熒光物鏡的色差校正和球差校正都更強,有些則只是強化了球差校正,另外即便同樣是熒光物鏡,不同鍍膜技術(shù)的差異,也會(huì )讓熒光物鏡在透過(guò)率方面出現差距,明美高透過(guò)率的熒光物鏡在熒光觀(guān)察和暗場(chǎng)觀(guān)察、正交偏光等觀(guān)察中更有優(yōu)勢。
平場(chǎng)消色差物鏡常用于醫院熒光鏡檢
使用熒光物鏡做熒光觀(guān)察,不僅目視成像背景更暗、熒光更明亮清晰,相機CCD成像的效果也會(huì )清晰銳利。那么對于已有平場(chǎng)消色差物鏡的用戶(hù)來(lái)說(shuō),能不能隨便買(mǎi)個(gè)熒光物鏡給自己的顯微鏡升級呢?
答案是否定的。這就需要補充剛剛提到但還沒(méi)講完的問(wèn)題,橫向色差的消除。
補償目鏡
在固定筒長(cháng)的舊時(shí)代,物鏡的橫向色差問(wèn)題很難解決,廠(chǎng)商的策略是以毒攻毒,用同樣有橫向色差,但差異率反過(guò)來(lái)的目鏡進(jìn)行補償,從而實(shí)現成像的消色差。如果不使用補償目鏡,成像畫(huà)面的外圍將會(huì )非常糟糕。
明美物鏡采用獨立消色差設計
到固定筒長(cháng)末期和無(wú)限遠光學(xué)時(shí)代,奧林巴斯和尼康終于實(shí)現在物鏡層面把橫向色差解決掉,稱(chēng)為“獨立色差校正",而蔡司和萊卡則沿用固定筒長(cháng)時(shí)代的策略,將補償橫向色差的任務(wù)交給了觀(guān)察頭底部的管透鏡和目鏡鏡,需使用跟物鏡配套的觀(guān)察頭才能消色差。明美物鏡采用的是獨立消色差設計,更便于實(shí)現高質(zhì)量的顯微相機成像和定制產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。
無(wú)限遠光學(xué)時(shí)代不同系統之間還有齊焦距離、齊軸性和基準焦距等差異,不建議用戶(hù)自行購買(mǎi)熒光物鏡進(jìn)行升級,以免出現兼容問(wèn)題導致效果不佳或使用體驗不好,升級物鏡請聯(lián)系原廠(chǎng)或明美等業(yè)的顯微鏡廠(chǎng)家。另外明美還提供LED數顯熒光模塊,適合把無(wú)限遠光學(xué)的普通顯微鏡升級成熒光顯微鏡,包括奧林巴斯CX23正置、尼康TS100倒置、蔡司V8體視等都可以。
總結:普通消色差物鏡可以校正紅藍色差和綠球差,足夠滿(mǎn)足醫院真菌檢查等常規熒光鏡檢;熒光物鏡(半復消色差物鏡)可以校正紅綠藍三色的色差和球差,熒光信號更強,信噪比更高,適合FISH熒光原位雜交等高要求的熒光成像。同時(shí)在偏光、暗場(chǎng)等其他觀(guān)察方式下,熒光物鏡也會(huì )有更好的表現,前提是升級的物鏡跟機身、觀(guān)察頭有良好的適配,建議找原廠(chǎng)或專(zhuān)業(yè)顯微鏡廠(chǎng)家升級。
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